TARCとCRACKレベルの論文 続きその4 免疫組織化学について
さて、今回はTARCの論文続きその4です。
実験手法－免疫組織化学について
生体組織検査で穴開けした組織標本(3 mm)が最重症のAD患者(n = 5)および健康体のコントロール用被験者(n = 3)の病変部皮膚から採取された。皮膚組織標本は液体窒素で瞬間冷凍し、Tissue-Tek (Sakura, Zoeterwoude, The Netherlands) OCT Compound ( Miles Inc)に埋め込み、-80℃で保存した。凍った6-μmの部分を切り出し、アセトン中に固定した。サンプルは羊の血清(DAKO, Glostrup, Denmark)中でインキュベートし、その後うさぎの対人間TARC（Pepotech, Rocky Hill, NJ)とともに1時間インキュベートした。その後、ビオチン結合型羊の対うさぎ IgG( Vector, Burlingame, Calif)とともに60分間インキュベートを行った。サンプルは最後にストレプトアビジン-AP(DAKO)とともに30分間インキュベートした。洗浄後、(PBS-Tween)、サンプルはアビジンビオチン標識したアルカリリン酸複合体(DAKO)で30分間インキュベートした。基質としてナフトールAS-BIリン酸(Sigma, Steinham, Germany)を使うことによるケモカインと赤い染色が可視化されるまで、色素源として新しいフクシン両方に対してAP活性を示した。外因性のAP活性はレバミソール(Sigma)を反応混合物に対して追加することで阻害した。サンプルは最後にMayerのヘマトキシリンで対比染色を行った。
免疫化学は私はほとんど知識がないため、この文章は訳はしましたがほとんど意味がわかりません。
ですが、この文章中のキーワードで調べてみると、どうやらビオチン標識という手法を使っているようです。
例えば、下の画像は同仁堂のビオチン標識キットからの引用ですが、恐らくこのような形でTARCのある部分を標識して顕微鏡で見えるようにしているのだと思われます。
引用元：http://www.dojindo.co.jp/letterj/113/commercial/05_main.html
結果のページにTARCが染色されている顕微鏡写真が出ています。
結果的にどんな色に染色されるのかというと、青紫と赤です。
赤がTARCを示していて、青紫はその対比で見えやすくするために細胞核の染色に使われます。
赤色の染料はフクシンと言われる物質で、以下に示すような色です。
引用元：フクシン - Wikipedia
そして、対比染色として細胞の核を染めるヘマトキシリンです。
どんな色を示すのか、実際Wikipediaの例に出ている画像を引用してみます。
これは非常にわかりやすいですね。
この青紫色がヘマトキシリンによって染色された部分です。
結果の部分は、また後日紹介します。
さて、実験方法の続きです。
実験手法－統計分析について
データはMann-Whitney U-testによって解析を行った。相関係数はスピアマンランク相関テストを使用して決定した。すべての比較は両側検定を使用した。P値は<.05で統計的に優位であるとした。
統計の方法については、U-testが使われているようです。これは、2つの母集団が異なる傾向を持つと考えられる時に使う検定手法です。
この論文では、健康な人とそれ以外のグループで比較が行われています。
その2群の間に、統計的に差があるかを検定したということです。
u-testについては、統計の解説をしている人たちにお任せしたいと思います。
以上が、Methodでした。
では、この次からいよいよこの論文の結果に入っていきます。
ではでは。
TARCとCTAKレベルとアレルギー疾患の関係についての論文続きその3 ELISA法
さて、論文紹介の続きその3です。
Methodの患者選別方法の続きからになります。
現在紹介している論文は次の通りです。
Hijnen, D., De Bruin-Weller, M., Oosting, B., Lebre, C., De Jong, E., Bruijnzeel-Koomen, C., & Knol, E. (2004). Serum thymus and activation-regulated chemokine (TARC) and cutaneous T cell- attracting chemokine (CTACK) levels in allergic diseases: TARC and CTACK are disease-specific markers for atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113(2), 334–40. http://doi.org/10.1016/j.jaci.2003.12.007
前回の論文の紹介内容も貼っておきます。
AD(アトピー性皮膚炎）の重症度の評価は、Leicester Sign Score(LSS; レンジ 0から108)で、その重症度のスコアは6つの臨床的特徴（赤み、化膿、すりむき、痂皮、感想あるいは鱗化、ひび割れや平行割れと苔癬化）が決められた6箇所の体の位置 で、スケールが0(なし）から3（重症）まででスコア化される。すべての455の血清に対してTARCレベルが決定された；163サンプルのサブセットよりCRACKレベルが決定された。
以前にも書きましたが、このLeicester Sign Scoreが東邦大学医療センターで使われているのか医師に聞きましたが、使われていないようでした。
そもそもスコア化した指標自体を使用していないようでした。
電子カルテには、問題のある箇所と、簡易的な人型の絵がありそれに塗り絵をする形で診察が行われていました。
6箇所というと、頭、胴体、左腕、右腕、左足、右足の6箇所でしょうか。あくまで推測ですが。
続けます。
7人の爆発的な炎症を起こしている重症なAD患者は血清TARCレベルとCTACKレベルが決定され、その測定は経口シクロスポリン(CsA) (3から5 mg/kg/ per day)の投与前と治療中に実施された。ADの重症度はLSSを使って評価され、治療に対する評価は内科医のグローバル評価(Physician's Global Assesment, PGA)によってスコア化された。PGAは患者の湿疹を0から5段階の総合評価で決め、ベースライン評価に対して相対的に障害のある部位の質と程度を考慮に入れた（ 0 = 綺麗 [100%] , 1 = ほぼ綺麗[90-99%の改善], 2 = 注目すべき改善 [50-89%], 3 = 中位の改善[50%以下] , 4 = 変化なし、 5 = 悪化）
これで患者とサンプルについては終わりです。
次は、ELISA法についての詳細です。
ELISA法の一般的な原理について説明します。
ELISA法とは
画像引用元：
ELISAとは、抗体と色の変色を使って物質の特定を行う方法です。
ELISAは”ウェット系”のラボで多く使われる方法で、生化学的な解析手法を用いています。酵素免疫測定法(EIA)を使って物質、特に水中の抗原を特定するのに用いられます。
まずは、抗原をマイクロプレートやガラスに固着させます（一番左）。
その後、抗体（Primary Antibody, 1次抗体）を固定された抗原に対して流し込み、結合させます。そして、Washして結合しなかった抗体を除去します（左から2番目）。
標識した抗体（Labeled Secondary Antibody, 標識2次抗体）を流し込み、1次抗体と結合させます。この二次抗体、緑色のユニットがくっついていますが、これは酵素で、この酵素が基質を取り込むと発光するようになっています。その後、Washして結合しなかった2次抗体を除去します（左から3番目）。
最後に、基質を流し込み、2次抗体が持っている酵素に基質を与えてやると発光するようになるので、それを検出します（左から4番目）。
これで何がわかるのでしょうか。
ある特定の抗原Aにしか反応しない抗体Aを最初に投下すると、抗体Aだけがくっつきます。他にある抗原B,抗原C,抗原D・・・・抗原Zには抗原Aはくっつきません。
最終的に、抗体Aがくっついた抗原Aの濃度がわかるという仕組みです。
今回の実験では、TARCを抗原としてその濃度をELISAを使って測定したということです。
ここで、実際に実験で行われたELISA法の方法を書いても良いのですが、恐らく意味不明になるので書くのはやめておきます。
続きはまたのちほど。
ではでは。
TARCとCTAKレベルとアレルギー疾患の関係についての論文続きその2 患者の選別について
さて、久しぶりに論文紹介です。
もうお忘れの方も多いでしょうから、簡単に紹介している論文の内容を書いておきます。
今紹介している論文は、TARCやCTACKというケモカインと呼ばれるシグナルがアトピー性皮膚炎に特有のマーカー（指標）になるのではないかという論文です。
前回はイントロの途中まで紹介しました。
さて、これの続きからです。
引用元論文についての情報：
Hijnen, D., De Bruin-Weller, M., Oosting, B., Lebre, C., De Jong, E., Bruijnzeel-Koomen, C., & Knol, E. (2004). Serum thymus and activation-regulated chemokine (TARC) and cutaneous T cell- attracting chemokine (CTACK) levels in allergic diseases: TARC and CTACK are disease-specific markers for atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113(2), 334–40. http://doi.org/10.1016/j.jaci.2003.12.007
Introduction途中から
内皮細胞,樹状細胞そしてケラチノサイトを含む様々な細胞のタイプ はTARCを生産すると示唆されてきた。更に、血小板が多量のTARCを持っていることもわかり、最近報告されたプラズマと血清TARCレベルの間に非常に大きな違いを生み出している。
内皮細胞(endothelial cells)、樹状細胞(dendritic cell, DC)、ケラチノサイト(Keratinocyte)ですが、画像がありました。
引用元：
Origin, homeostasis and function of Langerhans cells and other langerin-expressing dendritic cells
Nature Reviews Immunology 8, 935-947 (December 2008) | doi:10.1038/nri2455
内皮細胞は直接用語が書いてないですが、調べてみるとDermisという言葉の下にある細胞のことだと思われます。
これまでの研究によって示された、気管支上皮細胞と鼻腔上皮細胞内でのTARC生産によって、Allergic asthma(AA、アレルギー性喘息)とAllergic Rhintis(AR、アレルギー性鼻炎)においてTARCも何らかの役割を担っていると示唆された。しかしながら、アレルギー疾患を患う表現形的に非常にはっきりしている患者において血清レベルを臨床現場での調査は行われてこなかった。
CTAKは最近同定されたケモカインの一種で、皮膚に対して組織特異的にT細胞誘導を行うのに非常に重要な役割を担うと考えられている。CTACKは皮膚表皮のケラチノサイトで恒常的に発現しており、CCR10のリガンドである。
CCRはC-Chemokine Receptor 10の略で、７回膜貫通型タンパク質の１種です。
多分、なんのこっちゃわからない人もいると思うので、以前の記事を見てみてください。特定の物質が結合すると、細胞内部にシグナルを伝達して次の行動を起こさせるための受容体です。
さて、続きを書きます。
TARCと同様に、CTACKはCLA+ TH2細胞を末梢血から引きつけます。しかし、CTACKは表皮細胞で恒常的に発言していることから、通常の免疫活動中、皮膚を通して基本的なT細胞の移動に関わっている可能性があります。更に、in vitroの研究によって示されたのは、CTACKの生産が前炎症性サイトカインによって更に引き起こされることであり、血管系E-セレクチンの発現が増加するとともに、皮膚炎症中に皮膚において記憶T細胞が増加することを説明してくれる可能性がある。
この研究の目的は、アレルギー疾患におけるTARCとCTACKの血清レベルが増加するという特定性を調査し、TARCとCTACKをアトピー性皮膚炎（AD)患者における重症度の度合いのパラメータとして評価することである。最後に、我々は免疫化学的な手法を用いて、ADを患う患者の摘出標本でTARCとCTACKの部位特異的な研究を行った。
これでIntroductionは終わりです。
ちなみに、摘出標本は原文だとlesional skin biopsyです。
これはどういう手法なのかというと、以下の画像の通りです。
画像引用元
アトピー性皮膚炎なら炎症を起こしている部位の表皮から真皮に至る部分までを摘出して、それをスライスし顕微鏡で見ます。
割りと破壊的なメソッドみたいですね。結構痛いんじゃないでしょうか。
さて、次はMethodsです。
メソッドについて
患者とサンプル数
455人の人間の検体から血清を取得した(Table Ⅰ)。AD（アトピー性皮膚炎）患者の診断はHanifinとRajkaの手法に従って行った。AR（アレルギー性鼻炎）患者の診断はアレルギー症状の過去の履歴およびLebelらによって説明される、鼻刺激の陽性反応に従って行われた。AA（アレルギー性喘息）患者はメタコリンPC20を9.8 mg/mL以下持つもの、あるいはサルブタモールを吸入後9%以下の可逆性を見せたものを選抜した。
喘息の診断はピークフロー値を見て診断することが多いですが、病院に検査に来た時に正常な肺活量と診断される患者もいます。
その患者は病院に来た時には問題なくとも、他の時に喘息を発症している可能性もあり、それを試験するのがメタコリン負荷試験といいます。
私はメタコリン試験を受けるまでもなく、肺活量が小さすぎるし、肺炎が酷すぎて胸のX線写真が真っ白になっていて結核を疑われるほどでしたのでメタコリン試験は受けませんでした。
さて、メタコリン負荷試験についてです。
参考文献からまとめてみました。
参考
http://merckmanual.jp/mmpej/print/sec05/ch046/ch046b.html
メタコリンによって気管支を刺激し、擬似的に喘息の状態にします。
この状態でスパイロメトリー（呼吸機能検査）を行います。
この状態で、肺機能の20%を下回るような濃度のメタコリン濃度が1 mg/mL以下の場合は喘息と確定診断する。
16 mg/mL以上のメタコリン濃度の場合、喘息とはいえない。
1-16 mg/mLの場合、喘息かどうか確定ではないがどちらとも言えない状態
とのことです。
これはメルクのマニュアルからとってきた数値で、海外のデータと照らしあわせてみても妥当な数値のようです。
この論文では、メタコリン濃度9.8 ml/mL以下の人たちというフィルターを通しています。
これに加えて、メタコリン誘発試験後、サルブタモール（気管支拡張症）を吸入させ、呼吸機能が9%以上改善したものという第2のフィルターを通しています。
この2条件を通ったものだけが喘息と診断され、今回の論文でいうAA(Allergic Asthma)という表記になっています。
非常に厳格な定義です。
というわけで、今回はイントロの途中から、メソッドの患者の選別までを書いてみました。
次回は、患者の選別の続きから始めます。
ではでは。
今週の皮膚の状態。額は治療開始からほぼ変わらず。その他は改善傾向。認知療法でメンタルは改善するのか？
更新しようと思ってたらもうかなり時間が経ってしまった。
また仕事が1個増えて、今抱えている仕事は4個になってしまってかなりアップアップ。
すべてを同時に処理するのは無理なので、少しずつやっていますがそれでも追いつくかわかりません。
さて、今週の皮膚の状態ですが、額は相変わらず悪いです。
それ以外はほぼ、痒みがないレベルになってきました。
背中と腰が少しかゆいですが、それ以外はほぼ問題ないレベルと言えるでしょう。
以下、画像が来ますが、回復しているとはいえ皮膚の状態を見たくない人はブラウザバック推奨です。
今週の皮膚の状態画像
続きを読むTARCとCTAKレベルとアレルギー疾患の関係についての論文続き その１ ケモカインについて
書こう書こうと思っていて、ずいぶん経ってしまった・・・
以下、TARCについての論文で、過去記事の続きです。
論文のイントロダクションの中でも、特にTARCとそれを受容する受容体、そしてその受容体を持つT細胞について画像付きでわかりやすく解説します。
これのバックグラウンド知識について解説がありますので、そちらも御覧ください。
まずは、イントロダクションのところからです。
引用元の論文は、次の通りです：
Hijnen, D., De Bruin-Weller, M., Oosting, B., Lebre, C., De Jong, E., Bruijnzeel-Koomen, C., & Knol, E. (2004). Serum thymus and activation-regulated chemokine (TARC) and cutaneous T cell- attracting chemokine (CTACK) levels in allergic diseases: TARC and CTACK are disease-specific markers for atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113(2), 334–40. doi:10.1016/j.jaci.2003.12.007
イントロダクション
炎症性の細胞が組織に浸潤するは、ケモカイン(Chemokines)の制御によって調節されている。ケモカインは小さな分泌ペプチドであり、組織に特異的なリンパ球の導入と移動を制御している。その際にGプロテインと共役する7回膜貫通受容体を通してシグナルを送る。
ケモカインについては過去に説明しましたので、そちらをご覧いただくとして、Gプロテインについて軽く説明します。
図を見てください。
Gプロテインというのは膜を7回貫通しているタンパク質です。
G Protein Coupled-Receptor（GPCR)といいます。
このGPCRに神経伝達物質やホルモンが結合すると、それにともなって構造を変えて、細胞内部にシグナルを伝達するタンパク質です。
ここにケモカインが結合するというわけです。
画像引用元：
Li, J., Ning, Y., Hedley, W., Saunders, B., Chen, Y., Tindill, N., … Subramaniam, S. (2002). The Molecule Pages database. Nature, 420(6916), 716–7. doi:10.1038/nature01307
Tセル誘導する皮膚特有の重要なケモカインは 胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC)と皮下T細胞誘導性ケモカイン(CTACK)の2つを含んでいる。TARCの受容体はCCR4であり、皮膚誘導(Skin Homing)の、皮膚リンパ球抗原ポジティブT細胞(CLA+)で発現している。
言葉で言われても、やはりイメージしずらいですよね。
そこで、イメージで直感的に捉えるとわかりやすいものです。
この文ではTARCとCTACKがケモカインの一種で、T細胞のCCR4(C-Chemokine Receptor 4)に結合するという話が書いてあります。
CCR4は、上で書いたとおり、膜を7回貫通しているGPCRの一種で、細胞内部にシグナルを出します。
画像引用元：
Peter J. Barnes, New drugs for asthma, Nature Reviews Drug Discovery 3, 831-844 (October 2004) | doi:10.1038/nrd1524
上の画像では、喘息に関係する受容体のCCR2, CCR3と CCR4についての説明を図式化したものです。
ここに載っている細胞たちは基本的に炎症反応を起こすと言われていて、それが鼻で起これば鼻炎、気管支で起これば喘息、皮膚で起こればアトピーとなります。
だから、喘息持ちの人はアトピーになりやすいのは発現している場所が違うだけだからです。
ちなみに、僕は重症の喘息持ちでした。
CCR4というのは一番右側で、TARCがCCR4と結合して、シグナルを細胞内部に出して、未分化のT細胞がT Helper2細胞に変化するということみたいです。
CLA+についてですが、これも画像がありますのでイメージで捉えましょう。
画像引用元：
Thomas S. Kupper & Robert C. Fuhlbrigge, Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences, Nature Reviews Immunology 4, 211-222 (March 2004) | doi:10.1038/nri1310
抗原がやってくる→表皮で抗原提示細胞のランゲルハンス細胞が受け取る→ケモカイン（TARC,CTACKを含む)を分泌→CLA+ T細胞を誘導
という流れです。
Skin homing T-cellについて
紫外線が当たった時の皮膚内部の反応の画像を見つけました。
Skin homing T-cellはいわゆるT helper2細胞で、その受容体にCLA+とCCR4+を持っています。
Naive T-cellからskin homing T-cell(TH2 Cell)に変わります。
画像引用元：
Environmental cues, dendritic cells and the programming of tissue-selective lymphocyte trafficking, Hekla Sigmundsdottir & Eugene C Butcher
Nature Immunology 9, 981 - 987 (2008) Published online: 19 August 2008
doi:10.1038/ni.f.208
では、また続きです。
In vitroの研究においては、TARCによってTH2の表現系のリンパ球が選択的に移動させられていることがわかった。
皮膚や空気経路において、TH2表現系のエフェクター・記憶型CD4+ T細胞が浸潤することは、病気の原因、特にアトピー性皮膚炎(AD)、アレルギー性鼻炎(AR)、そしてアレルギー性喘息(AA)において重要な役割を持っている。カキヌマらによって、最近わかったことは、乾癬性の患者や健康な人の被験者（HCs)より血清TARCレベルが上昇していることであった。更に、血清TARCのレベルがADの重症度と相関していることも示されていた。
というわけで、以前カキヌマさんたちが行った実験によってTARCレベルとアトピー性皮膚炎患者の重症度と相関性があることが示されていました。
この研究はその追試を行う意味があると考えられます。
さて、長くなってきたのでまた続きは今度にしましょう。
ではでは。
皮膚の状態はちょい悪。精神状態は良くなった。かなり眠れるようになった！あと心療内科の先生が微妙な件
今週の皮膚の状態ですが、ちょっと悪化しました。
原因として考えられるのは、
- 温度の上昇による汗をいたこと（最近30℃近くが多くて汗が止まらない）
- 入浴回数が減ったこと（忙しさにかまけて2日に1回ほどでした）
- ザイザルが効かないこと（代わりにアレロック飲んでます）
- 髪が少し伸びてきたこと（接触性の皮膚炎になっている？）
ですね。
僕の中で問題になっているのは、ザイザルが効かないことです。
ザイザルはセチリジンという成分の光学異性体のうち、R体だけ集めてきたものです。
光学異性体というのは、分子の形状の説明で手のひらと同じく、右手と左手のように同じ形をしているけど鏡に写したような関係の分子構造のことを指します。
R体というのはギリシャ語で右手を意味しています。
R体がセチリジンの中でも特異的にヒスタミンと拮抗作用を持っていて、よりヒスタミンが結合するのを防いでくれます。
ヒスタミンの代わりにセチリジンという成分が結合するために、ヒスタミンがC-fiberに結合できなくなって痒みを発生しなくなるという作用機序です。
これについては論文をあたってみたいと考えています。
私の場合、セチリジンが全然効かなかったので、ザイザルも効くか不安でしたがやっぱり効きませんでした。
痒みが通常通り出てしまいます。
なぜ効かないのか、作用機序を見てみないことにはちょっと考察のしようがないですね。
作用機序を見ても、1塩基多型のおかげで（要するに個人差）効かないとなれば自分には効かない原因の検討がつきません。
いわゆる体質的に効かなかったということになります。
何か他に改善するところがあれば改善して”薬を効かせられる”状態に果たしてできるのかは作用機序をチェックしてみる必要があります。
恐らくないとは思いますが・・・・。
今は残りのアレロックを飲んで凌いでいます。
今週の皮膚の写真。額がかなり酷い。。。
今週の皮膚の写真です。
見たくない方はブラウザバック推奨です。
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